大熊猫IFN
2024-11-01 23:04
大熊猫(Ailuropoda melanoleuca),我国特有珍稀野生动物,属国家一级濒危保护物种。随着近年来圈养大熊猫的增多,增加了熊猫与人类“亲密接触”的机会,使得大熊猫疫病的流行背景变得愈加复杂,病毒性疾病发病率逐渐上升。干扰素γ(Interferon-gamma, IFN-γ)是细胞因子家族的重要成员,主要由自然杀伤细胞(NK细胞)和T细胞分泌,是Ⅱ型免疫干扰素的唯一成员。干扰素γ能够调节巨噬细胞、T/B细胞间的关系,增强免疫应答,还具有抗病毒、抗肿瘤等多种生物学活性；广泛应用于多种疾病的预防和治疗。但其在体内半衰期短、易发生酶解,需频繁给药。高分子纳米载药系统是近几十年研发的新型给药系统,既可以增加药物的穿透力、靶向性和稳定性,又能保护蛋白类药物免遭破坏,延长药效。其中聚氰基丙烯酸正丁酯(Polybutylcyanoacrylate, PBCA)是一种极富潜力的纳米载药材料,拥有良好的生物相容性和可降解性,没有免疫原性,安全性高。本试验选取PBCA作为载体材料,大熊猫干扰素γ为药物模型,制备纳米球(IFNy-PBCA-NS),以期优选出最佳的制作工艺,为进一步研究包封大熊猫多肽类药物微粒提供参考依据,为大熊猫疾病诊疗提供新的思路,主要结果如下：1.本试验从刀豆凝集素A诱导的大熊猫外周血淋巴细胞中提取总RNA,成功扩增出大熊猫IFN-y基因。结果显示所得IFN-y基因共465 bp,与GenBank中的大熊猫IFN-y基因相比较,匹配率达96%-99%,没有缺失变异等情况。再将测序成功的产物连接到原核表达载体上,利用大肠杆菌系统进行培养。经IPTG诱导的重组蛋白约33.5 kD,主要以包涵体的形式存在。采用Ni柱亲和层析柱纯化蛋白,并梯度透析复性,经核酸蛋白酶仪测定,蛋白浓度为0.46 mg/mL。采用VSV-WISH系统测定干扰素的抗病毒活性,结果为3.2×105U/mg。2.采用乳化聚合法制备IFNy-PBCA-NS结果显示,所得纳米球为骨架型纳米球,经电镜观察纳米球外观规整,粒径在50 nm～200 nm之间,跨距0.55,大小较均匀,包封率为56.7%,载药量为0.86%。在优化纳米球制备条件试验中,确定pH值6-6.5、BCA用量5-10 g/L、poloxamer188用量5～10 g/L、IFN-γ用量小于0.8 g/L的条件范围内均有利于纳米球的制备,不易出现粘连、分散不均等情况。小鼠药效试验结果表明,sc-IFNy-PBCA-NS组生命延长率(RLML)最显著,IFNγ-PBCA-NS组整体效果优于IFN-y组。SPSS软件方差分析,可得ig-IFN-y组与ig-IFNy-PBCA组的RLML差异极显著(P0.01)；sc-IFN-γ组与sc-IFNγ-PBCA组RLML差异显著(P0.05)。说明包被后的IFN-γ在体内抗病毒作用增强,采用PBCA为载药材料制备的大熊猫IFN-γ纳米球具有一定的缓释作用。